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肿瘤微环境响应型纳米制剂研究进展
[摘要]肿瘤微环境响应型纳米制剂由于能够在靶器官选择性释药，促进肿瘤细胞摄取，已成为癌症治疗的有效手段。肿瘤微环境中的酸性环境、酶、细胞质和细胞核中的谷胱甘肽等均可被用作为内源性的刺激，使得药物在肿瘤组织或细胞中响应性释放，改善药物的组织分布、降低药物的副作用。围绕对肿瘤微环境具有pH响应、酶响应、温度响应和还原响应的纳米制剂，综述其基本原理、设计方法及研究进展，为抗肿瘤纳米制剂的开发提供参考。
肿瘤细胞和肿瘤间质细胞，以及细胞外基质和多种细胞因子、趋化因子等一同构成了肿瘤的微环境。与人体正常内环境相比，肿瘤微环境具有弱酸性、低氧和某些酶表达上调等生理特性。这些区别于正常内环境的生理特征，为纳米靶向制剂的研究提供了新方向。与目前临床应用的阿霉素（Dox）脂质体和紫杉醇白蛋白纳米粒等普通纳米制剂相比，肿瘤微环境响应型纳米制剂能够提高药物在体内的递送效率，实现靶向给药、增强药物疗效并减少药物不良反应，因而肿瘤微环境响应型纳米制剂已成为肿瘤治疗的有效手段之一。本文将着重介绍肿瘤微环境响应型纳米制剂的原理、方法以及研究进展。
1pH响应型纳米制剂
20世纪30年代首次提出的Warburg效应说明了肿瘤细胞在氧含量正常的情况下糖酵解活跃，导致代谢产物乳酸含量增加。因此，肿瘤微环境呈pH6~7的弱酸性，肿瘤细胞内pH更可低至4~6。目前针对Warburg效应设计的药物递送系统主要有以下3种：1）当纳米材料的pKa（酸解离常数）与肿瘤间质的pH相近时，将触发纳米材料官能团的质子化，进而诱发载体材料的亲疏水性改变，实现药物的快速释放，如含有组氨酸、聚组氨酸、叔胺和磺酰胺等基团的材料；2）通过pH响应的敏感键连接药物，在近中性环境下这类化学键保持相对稳定，在肿瘤间质酸性环境中稳定性降低或电荷解离甚至断裂，释放药物，进而提高纳米粒的递药效率，比较典型的pH敏感键有缩醛键、酯键、腙键、亚胺键、肟键等；3）利用具有pH响应性插入肽修饰的纳米载体，在肿瘤间质酸性环境中，这类响应肽的构象发生改变，形成稳定的跨膜复合物，进而促进纳米粒的内吞。1.1亲水性-疏水性转化在弱酸性环境中，pH响应性基团发生质子化，使得其结构的亲水性-疏水性发生转化，降低了药物分子与载体材料之间的作用力，促进了药物的释放，进而提高纳米粒的递药效率。Ramasamy等采用自主设计的多肽即聚（苯丙氨酸）-b-聚（L-组氨酸）-b-聚乙二醇），构建了溶酶体酸性pH环境响应型的Dox和槲皮素（QUR）的共递送纳米系统（DQ-NV）。在聚合物中，聚苯丙氨酸嵌段提供了稳定的疏水核心，而聚组氨酸是pH响应型多肽，在不饱和氮上具有孤对电子，在细胞内环境中发生质子化-去质子化过程，产生的亲疏水性质变化及静电斥力导致DQ-NV的解体，促进了药物的胞内释放。Zhang等用两亲性聚（β-氨基酯）（TPGS-PAE）制备了pH敏感纳米粒（NPs），用于Dox与姜黄素（Cur）的共递送给药。通过优化TPGS-PAE共聚物，制备的NPs具有增强的pH敏感性和生理环境稳定性。在肿瘤细胞酸性微环境下，PAE核心中叔二胺部分质子化转变为亲水性结构，从而释放药物Dox和Cur。体外研究结果显示，与pH7.4条件下观察到的稳定的粒径相反，在pH5.8的酸性条件下纳米粒粒径在12h内显著增加；同时随着PAE内核的解体，快速释放出Dox和Cur，进而产生更高的细胞毒性。肿瘤间质酸性环境不仅可以触发药物的释放，还可以改善纳米粒与肿瘤细胞之间的相互作用，提高纳米粒的细胞摄取效率。Ling等分别制备了儿茶酚基修饰的聚乙二醇-聚组氨酸（PEG-polyHis）和二氢卟酚e6（CE6）修饰的PEG-polyHis，其中儿茶酚基可以锚定到氧化铁纳米粒表面，CE6则作为荧光探针和光动力治疗的光敏剂，利用上述2种材料可以制备肿瘤酸性环境响应的磁性纳米粒。在pH7.4条件下，polyHis链包裹在氧化铁纳米粒表面，此时CE6的荧光和氧化铁纳米粒的T1弛豫均被抑制。pH下降导致polyHis的质子化，电荷翻转。电荷翻转不仅促进纳米粒的摄取，而且诱发氧化铁纳米粒的释放。在溶酶体中，polyHis的质子化程度加剧，疏水作用力进一步减小，导致了纳米粒的解聚，CE6荧光以及T1弛豫的恢复，进而激活了单线态氧的产生。又如通过将靶向肽Arg-Gly-Asp（RGD）与三嵌段聚合物聚（2-（六亚甲基亚氨基）甲基丙烯酸乙酯）-聚（低聚（乙二醇）甲基丙烯酸单甲醚）-聚（还原响应型喜树碱）（PC7A-POEG-PssCPT）共价相连，Wang等制备了肿瘤环境中分级响应纳米药物（HRNM）（见图1）。聚（2-（六亚甲基亚氨基）甲基丙烯酸乙酯）（PC7A）是一种pH超敏的聚合物，其在pH约6.9时能够发生亲水-疏水转变。在血液循环中，RGD肽被低聚（乙二醇）单甲基醚甲基丙烯酸甲酯（POEG）层包裹在内部实现屏蔽，因此HRNM可以通过被动靶向实现肿瘤部位的有效累积。一旦HRNM到达肿瘤部位，在酸性肿瘤微环境下PC7A链发生疏水-亲水转化，RGD肽将暴露在HRNM外部以增强肿瘤部位滞留和细胞摄取。进入肿瘤细胞内部后，在细胞内谷胱甘肽（GSH）作用下产生二级响应，还原性二硫键断裂，释放出化疗药物喜树碱（CPT），有效地降低了药物的全身毒性并且产生了良好的抗肿瘤效果。
近年来，蠕虫状聚合物胶束被认为是一种具有长循环特性、易于人体吸收的载体材料。尽管修饰肿瘤识别的抗体，可以有效提高蠕虫状纳米载体的生物相容性和可降解性。然而蠕虫状结构却限制了其体内行为，尤其是非选择性释放导致了其相对较低的递药效率。因此肿瘤微环境响应型蠕虫状纳米载体的设计被认为是提高递药效率的有效途径。如Lee等利用mPEG（A）和3-二乙基胺丙基化的聚赖氨酸poly（Lys-DEAP）（B）设计了pH响应的AB2型杂化嵌段共聚物。在pH7.4的条件下，pH响应型DEAP可作为疏水性内核，而在pH6.8的环境中，质子化的DEAP促进了纳米粒的降解。pH6.8酸性环境触发的纳米粒变构和降解，导致了单线态氧的大量生成，进而使制剂的光毒性大大提高。
由于磺酰基中的氧原子可以从硫原子获得电子，导致与磺酰基相连的氮原子（磺基上的仲胺基团）的电子云发生偏移，因此在近中性条件下，连有仲胺的磺胺基团非常容易离子化，这使得N-H键的电子云偏向N原子，进而释放质子。例如，Cyphert等将2种不同的磺酰胺基团修饰在聚（N-异丙基丙烯酰胺）基聚合物胶束表面，赋予了温敏胶束pH敏感的特性。2种pH响应部分为磺胺二甲氧嘧啶（SD）和磺胺二甲嘧啶（SA），它们的pKa在肿瘤微环境pH范围内（SD：pKa=6.10和SA：pKa=7.25）。当胶束处于pH接近其pKa的环境中时，首先经历相变，磺酰胺基团释放质子并疏水化，能够更好地与疏水性细胞膜相互作用，并最终能够被摄取进入细胞中。2种胶束在温和的酸性（pH6.8）条件下均显示出更好的细胞摄取效果（相较于pH7.4）。结合其温敏特性，该体系具有实现高度特异性的细胞摄取潜力。如Mizuhara等利用烷氧基苯基磺胺制备了新型两性配体，并用于金纳米粒的修饰。当pH下降至约6.8，磺胺失去负电荷，使得金纳米粒带有正电荷，增加了细胞摄取。
1.2pH敏感键的断裂
利用pH敏感的化学键设计载体，如缩醛键、酯键、腙键、亚胺键、肟键等，能够在肿瘤环境实现药物的控制释放。Liu等研究了基于隐形纳米囊的药物递送系统，其以牛血清白蛋白（BSA）为核心，在周围包封聚（2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱）（PMPC）和苯甲醛基团，并且通过pH敏感型的苯甲酸-亚胺键连接Dox。体外研究结果显示，Dox-连接的纳米囊（nBSA-Dox）能够在酸性肿瘤微环境（pH约为6.5）下释放药物并杀死HepG2人肝癌细胞。nBSA-Dox小鼠体内半衰期显著延长，并且其曲线下的面积（AUC）是游离Dox的倍。Dox的体内循环时间得到明显延长，并且能够在肿瘤部位有效蓄积，从而显著抑制肿瘤生长。
在上述利用pH响应化学键断裂控制药物释放的基础上，可进一步将药物本身设计成为“门控”分子，实现自身响应释放的同时，还可控制其他药物分子的释放。Cheng等递送药物Dox设计为“门控”分子，即在弱碱性条件下，将Dox的氨基与介孔二氧化硅纳米粒（MSN）的苯甲醛基团之间形成苯甲酸-亚胺共价键。苯甲酸-亚胺共价键是pH高度敏感的化学键，可在肿瘤组织或细胞酸性条件（pH6.8）下断裂，使得MSN孔道中装载的siRNA及“门控”分子Dox在所需部位实现可控的共递送（见图2）。由于采用抗癌药物本身充当“门控”分子，该递药系统不仅可以有效地降低全身性副作用，还能将其他额外的封口剂带来的潜在风险降至最小。
1.3低pH插入肽
低pH插入肽[pH（low）insertionpeptides，pHLIP]的结构特征是末端均含有一个侧翼序列，并且在中间有一个跨膜序列（见图3）。在碱性和中性pH条件下，插入肽以非结构化单体形式存在。在酸性环境中，跨膜序列中的谷氨酸残基和天冬氨酸羧基以及C末端均被质子化，插入肽的疏水性增强，导致界面螺旋的形成，这可以将肽自身插入到细胞膜的疏水双分子层中。插入肽插膜时具有一定的方向性，通常为C端穿过双分子层进入细胞质，而N末端保持在外侧。研究表明，温度越高，对该跨膜过程越有利，并且在酸性条件下插入肽和双分子层的亲和力是碱性环境中的30~50倍。
这种pH依赖性的膜插入技术广泛应用于肿瘤症靶向制剂的研究中。利用其肿瘤酸性环境触发的折叠并快速插入细胞的脂质双层的特性，可促进纳米材料的细胞摄取，增强在肿瘤部位滞留。Tian等用pHLIP修饰金纳米粒（GNS），以提高其靶向能力和光热治疗（PTT）效率，所获得的GNS-pHLIP具有均匀粒径和良好生物相容性等特点。与GNSmPEG相比，在pH6.4的培养基中与细胞孵育2h后，GNS-pHLIP的细胞摄取量提高了1倍，体内药效研究显示GNS-pHLIP在肿瘤内聚积量较GNS-mPEG高3倍。此外，GNS-pHLIP通过计算机断层扫描（CT）和光声（PA）成像显示出比GNS-mPEG更强的信号。理想的靶向效率和摄取效果显著提高了对肿瘤的PTT功效，并且降低了对正常组织的副作用。Wei等制备了以pHLIP修饰的肿瘤酸性微环境靶向pH响应型超顺磁性氧化铁纳米粒（SPION）。首先成功以pHLIP修饰聚赖氨酸聚合物，其能够在酸性pH下形成膜结合的α-螺旋插入模式。更重要的是，该聚合物在浓度增加的情况下能够可控地将SPION组装成不同粒径的纳米团簇（64、82、和nm）。64nm的pH响应型SPION纳米团簇在细胞中表现出最有效的pH响应滞留，在磁共振成像（MRI）中表现出肿瘤选择性成像。在3种不同的肿瘤模型中，pH响应型SPION对肿瘤内部的特异性对比度增强证明，通过pHLIP靶向肿瘤酸性微环境的策略用于肿瘤早期检测和MRI诊断的临床潜力。
Adochite等对比了野生型（WT-pHLIP）和变异型膜插入肽（Var3-pHLIPs和Var7-pHLIPs）的肿瘤靶向性，结果显示与野生型膜插入肽相比，Var3-pHLIPs和Var7-pHLIPs的体内半衰期缩短；4T1和自发性乳腺癌荷瘤小鼠体内组织分布学研究结果表明，上述3种膜插入肽均表现出较好的肿瘤靶向性，在正常组织的分布较少。此外，这种pH依赖性插入肽也被用作一些极性物质如鬼笔环肽毒素、siRNA等的胞内递送。这些极性分子通过可裂解的二硫键结合到膜插入肽的C末端，形成复合物，在进入细胞之后，随着二硫键的断裂，导致极性分子在细胞内的释放。除了能将小分子跨细胞递送到细胞内，这一插入肽技术还能提高纳米粒靶向递药效率，如Yao等已将这类肽用于金纳米粒的肿瘤内递送，经膜插入肽修饰后，金纳米粒在肿瘤中的灌注显著增强。再如Zhao等用类似的方法，构建了膜插入肽包被的MSN。在该体系中，膜插入肽通过可裂解的二硫键结合到MSN的表面。结合在二氧化硅表面的肽不仅可以起到靶向跨膜传递的作用，还可以阻断药物从纳米粒的孔隙中扩散。
2酶响应型纳米制剂
与正常细胞不同，肿瘤细胞会分泌过量的酶，这些过表达的酶为肿瘤微环境响应型药物载体的设计提供了新靶点。
2.1基质金属蛋白酶响应
基质金属蛋白酶（MMPs）是一类能分解细胞外基质的蛋白酶，这些酶在正常的生理活动中发挥着重要作用，如组织重构、炎症和血管生成等。但MMPs在肿瘤微环境中过度表达，促进了肿瘤细胞从原发部位向其他部位的转移，如MMP2和MMP9在胃癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌等多种癌症中均高度表达。MMPs介导的靶向递药系统可以分为下面几种类型。
2.1.1MMP特异识别并裂解载体
抗癌药物可以通过能被MMP特异识别结构与纳米载体结合，并通过MMP裂解该结构，释放药物。例如，为了使药物更好地在肿瘤部位释放并且深入穿透，Liu等研究了能够在肿瘤部位特异性响应MMP2产生粒径变化的纳米递药体系GNP-Dox-Lac，该纳米递药系统由明胶纳米颗粒（GNP）表面连接前药阿霉素-乳糖（Dox-Lac）构成。GNP-Dox-Lac在血液循环中具有良好的稳定性，并且在EPR作用及乳糖介导肿瘤靶向的双重作用下蓄积在肿瘤部位。进入肿瘤组织后，明胶作为肿瘤中过表达的MMP2的底物被降解，释放出小分子前药Dox-Lac。利用前药小分子及亲水特性深入渗透到肿瘤中，并通过乳糖与去唾液酸糖蛋白-1受体（ASGPR1）的相互作用促进Dox摄取。因此，通过GNP-Dox-Lac的MMP2响应粒径转变特性克服了肿瘤蓄积和肿瘤穿透之间存在的粒径要求矛盾，实现了肿瘤微环境响应的药物释放及通过细胞间隙的深度穿透，并且该体系具较低的体内毒性和较高的肿瘤抑制率（90.8％）。
2.1.2MMP门控释放
MMP可裂解的肽作为纳米粒释放药物的“控制门”，防止药物突释。MSN是一种多孔结构的药物载体，载药量高，通常每克MSN可携带~mg药物，部分甚至能携带mg，但是该类载体的缺点是装载的药物容易泄漏，造成毒副作用，降低递药效率。在生理条件下，覆盖于MSN表面的生物高分子材料（如透明质酸、叶酸或靶向肽等）阻止了药物从其中逃逸出来，一旦到达肿瘤部位，大量存在的MMP将其裂解，使得药物释放。与上述第1种方法相比，这种方法能够保持药物最初的完整形态，因而不会导致药效降低。
2.1.3MMP作为连接键
以MMP作为可断裂的连接键，尽管PEG化可以延长纳米粒的长循环时间，但其妨碍了纳米粒的细胞摄取。如利用MMP敏感键连接PEG后，纳米粒既可以拥有较长的血液循环时间，又能较好地在靶点部位进行细胞摄取。Zhu等以Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln为连接键，将转录反式激活因子（TAT）细胞穿透肽靶向的纳米粒包封于外层的PEG中（见图4）。体外细胞摄取实验结果显示，与不给予MMP2的对照组相比，MMP2孵化制剂组的细胞内化效果更好。尽管穿膜肽（CPPs）能够有效介导外源性生物大分子或纳米载体的摄取，但这种缺乏特异性的穿膜作用限制了其体内应用，因此近年来可活化细胞穿膜肽（activatablecell-penetratingpeptides，ACPPs）受到越来越多的重视。可活化指利用一定方法“屏蔽”穿膜肽的活性，在肿瘤部位恢复其活性，进而改善跨膜性。基于多靶向肽-LinTT1和细胞穿透肽-TAT组成的多功能多肽-LitTT1-PVGLIG-TAT（LPT），Zhang等将其与包载化疗药物的载体整合，制备了一种新型肿瘤微环境和肿瘤细胞双靶向纳米粒。采用MMP敏感性片段-PVGLIG在TAT的第4个赖氨酸上连接LinTT1，能够很大程度上降低TAT的跨膜转运能力，其细胞穿透能力将被屏蔽直至被肿瘤细胞中丰富的MMP识别。该设计可有效降低TAT的非选择性引起的正常组织的毒理学风险。
2.2组织蛋白酶B响应
另一种较常使用的作为酶响应型纳米制剂的肽序列即Gly-Phe-Leu-Gly，其可特异性地被肿瘤细胞中高表达的溶酶体酶（组织蛋白酶B）裂解。为增加肿瘤组织近红外（NIR）成像及光疗特异性，Chen等开发了以Gly-Phe-Leu-Gly作为连接序列，可被组织蛋白酶B激活的荧光探针CyA-P-CyB。体外实验显示，CyA-P-CyB通过肿瘤细胞中组织蛋白酶B切割肽连接序列从而被活化，并基于荧光共振能量转移（FRET）机制在NIR区域产生荧光。噻唑蓝（MTT）试验测定结果显示，CyA-P-CyB对细胞的光毒性取决于组织蛋白酶B的活性，并且显示出对肿瘤细胞的特异性光毒性。组织学分析表明，在CyA-P-CyB处理和激光照射后，CyA-P-CyB对7种小鼠组织（肺、肝、心脏、肾、胰腺、脾和脑）均无细胞毒性。
3温度敏感型纳米制剂
与正常组织相比，肿瘤组织和炎症组织常有高热现象。利用磁感应、超声波、热水浴等方法对肿瘤部位加热，肿瘤部位血流量增大并且血管渗透性增强，增加了制剂在肿瘤组织的蓄积量，进而促进肿瘤细胞凋亡，因此温度敏感型纳米载体材料广泛应用于靶向纳米制剂的构建。
3.1温敏脂质体
在高于生理体温的相变温度条件下，温敏脂质体流动性增强，通透性增加，可迅速、有效地释放药物，因此温敏脂质体的相变温度测定是制备温敏脂质体的关键参数，目前常采用差示扫描量热法（DSC）或热敏释放百分率等方法进行评价。DSC即通过分析各样品的DSC曲线分析温敏脂质体被加热时相转变的情况，但制备工艺、修饰分子可能会影响温敏材料的温敏性，限制了温敏脂质体的进一步临床应用。如Hennink课题组制备了不同相对分子质量胆固醇锚定的N-异丙基丙烯酰胺/乳酸温敏材料（chol-pHPMAlac），并将该温敏材料用于脂质体的构建。该研究考察了不同孵育温度对Dox载药脂质体的体外释放药物速率的影响，发现脂质体的起始释药速度和chol-pHPMAlac的浊点具有良好的相关性。在42℃条件下，利用浊点为11.5℃的chol-pHPMAlac所构建的载药脂质体，5min累积释放药物89%，而采用浊点为25.0℃的chol-pHPMAlac所构建的载药脂质体需在52℃条件下达到同样的释放速度。当脂质体处方中cholpHPMAlac的质量分数为5%时，随着温度的升高，脂质体的释药速度加快，而对于处方中cholpHPMAlac的质量分数分别为2%和10%的脂质体，随温度的升高纳米粒的释药速率无明显增加。
3.2温敏性嵌段共聚物
温敏性两亲嵌段聚合物可以在水中自组装成以疏水基团为内核、亲水基团为外壳的胶束，并且对溶液温度的改变产生响应，因此其受到广泛
